Η χρώση Gram είναι μια γρήγορη τεχνική και χρησιμοποιείται για να δει την παρουσία βακτηρίων σε ένα δείγμα ιστού και για να ταξινομήσει τα βακτήρια ως Gram-θετικά ή Gram-αρνητικά, με βάση τις χημικές και φυσικές ιδιότητες των κυτταρικών τοιχωμάτων τους. Ο λεκές Gram χρησιμοποιείται σχεδόν πάντα ως το πρώτο βήμα στη διάγνωση μιας βακτηριακής λοίμωξης.
Αυτή η τεχνική χρώσης πήρε το όνομά της από τον Δανό επιστήμονα Hans Christian Gram (1853 - 1938), ο οποίος ανέπτυξε την τεχνική το 1882 και τη δημοσίευσε το 1884 ως τεχνική διάκρισης μεταξύ δύο τύπων βακτηρίων με παρόμοια κλινικά συμπτώματα: Streptococcus pneumoniae (επίσης γνωστό ως Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) και τα βακτήρια Klebsiella pneumoniae.
Βήμα
Μέθοδος 1 από 3: Προετοιμασία της διαφάνειας του μικροσκοπίου
Βήμα 1. Προετοιμαστείτε για εργασία στο εργαστήριο
Φορέστε γάντια και γραβάτα με μακριά μαλλιά για να αποφύγετε τη βακτηριακή μόλυνση του δείγματος που δοκιμάζετε. Καθαρίστε τον χώρο εργασίας κάτω από απορροφητήρα, ή σε άλλο καλά αεριζόμενο χώρο. Ελέγξτε τον καυστήρα Bunsen και βεβαιωθείτε ότι το μικροσκόπιο λειτουργεί σωστά πριν ξεκινήσετε.
Βήμα 2. Αποστειρώστε τη γυάλινη πλάκα μικροσκοπίου
Εάν η γυάλινη πλάκα είναι βρώμικη, πλύνετε την με σαπουνόνερο για να αφαιρέσετε το λάδι και τη βρωμιά. Καθαρίστε τις πλάκες με αιθανόλη, καθαριστικό γυαλιού ή άλλη μέθοδο που χρησιμοποιείται από το εργαστήριό σας.
Βήμα 3. Τοποθετήστε το δείγμα στη γυάλινη πλάκα
Μπορείτε να χρησιμοποιήσετε την τεχνική χρώσης Gram για να προσδιορίσετε τα βακτήρια σε ένα ιατρικό δείγμα ή μια καλλιέργεια βακτηρίων που αναπτύσσονται σε ένα πιάτο petri. Για καλύτερα αποτελέσματα, χρησιμοποιήστε λεκέ Gram σε λεπτές πινελιές του δείγματος. Συνιστάται η χρήση δειγμάτων ηλικίας μικρότερης των 24 ωρών, καθώς τα παλαιότερα βακτήρια μπορεί να έχουν βλάψει τα κυτταρικά τοιχώματά τους και να μην ανταποκρίνονται στη χρώση Gram.
- Εάν χρησιμοποιείτε δείγμα ιστού, προσθέστε 1-2 σταγόνες σε γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα. Απλώστε ομοιόμορφα στη διαφάνεια για να σχηματίσετε ένα λεπτό στρώμα δείγματος ψεκάζοντας, σύροντάς το χρησιμοποιώντας την άκρη της άλλης αποστειρωμένης γυάλινης αντικειμενοφόρου πλάκας. Αφήστε το να στεγνώσει πριν κάνετε το επόμενο βήμα.
- Εάν παίρνετε βακτήρια από ένα πιάτο petri, αποστειρώστε το βρόχο εμβολιασμού σε ένα καυστήρα Bunsen μέχρι να λάμψει και, στη συνέχεια, αφήστε το να κρυώσει. Χρησιμοποιήστε το βρόχο για να στάξετε αποστειρωμένο νερό στη διαφάνεια, στη συνέχεια αποστειρώστε και ψύξτε ξανά πριν το χρησιμοποιήσετε για να συλλέξετε ένα μικρό δείγμα βακτηρίων. Μετά από αυτό, ανακατέψτε απαλά.
- Τα βακτήρια που παρασκευάζονται στο ζωμό πρέπει να αναδεύονται ξανά χρησιμοποιώντας έναν στροβιλιστή, στη συνέχεια να λαμβάνονται με τον βρόχο εμβολιασμού όπως παραπάνω, χωρίς προσθήκη νερού.
- Εάν έχετε δείγμα μπατονέτας (συνήθως γίνεται με μια μικρή λαβή με άκρη από βαμβάκι), αγγίξτε και περιστρέψτε απαλά το μάκτρο πάνω από τη διαφάνεια.
Βήμα 4. Μια ελαφρώς υψηλή θερμοκρασία μπορεί να κάνει ένα καλό επίχρισμα
Η θερμότητα θα συγκρατήσει τα βακτήρια πάνω από την αντικειμενοφόρο πλάκα, έτσι ώστε να μην διαλύονται εύκολα κατά τη διάρκεια της διαδικασίας χρώσης. Αγγίξτε τη διαφάνεια γρήγορα δύο έως τρεις φορές πάνω από έναν καυστήρα Bunsen ή θερμάνετε τη διαφάνεια πάνω από μια ηλεκτρική θερμάστρα. Μην υπερθερμαίνετε, το δείγμα μπορεί να υποστεί ζημιά. Εάν χρησιμοποιείτε καυστήρα Bunsen, θα πρέπει να είναι μια μικρή αλλά μπλε φλόγα αντί για μια μεγάλη πορτοκαλί φλόγα.
Εναλλακτικά, ένα επίχρισμα μπορεί επίσης να γίνει με μεθανόλη, προσθέτοντας 1-2 σταγόνες μεθανόλης σε ένα στεγνό επίχρισμα, στέγνωμα της υπόλοιπης μεθανόλης στο πλακίδιο αφήνοντάς την στον ύπνο. Αυτή η τεχνική ελαχιστοποιεί τη βλάβη των κυττάρων και παρέχει καθαρό φόντο εικόνας διαφάνειας
Βήμα 5. Τοποθετήστε τη διαφάνεια πάνω στο δίσκο χρωματισμού
Οι δίσκοι χρώσης είναι κατασκευασμένοι από μέταλλο, γυαλί ή ρηχές πλαστικές πλάκες με μαλακό πλέγμα στο επάνω μέρος. Τοποθετήστε τις διαφάνειες πάνω από αυτά τα δίχτυα, έτσι ώστε το υγρό που χρησιμοποιείτε να στραγγίσει στο δίσκο.
Εάν δεν έχετε δίσκο χρωματισμού, μπορείτε να τοποθετήσετε μια διαφάνεια σε ένα πλαστικό δίσκο για να εκτυπώσετε παγάκια
Μέθοδος 2 από 3: Διαδικασία λεκέδων Gram
Βήμα 1. Ρίξτε το κρυσταλλικό ιώδες υγρό πάνω στο επίχρισμα
Χρησιμοποιήστε μια πιπέτα για να ψεκάσετε ένα δείγμα βακτηρίων με μερικές σταγόνες κρυσταλλικής ιώδους βαφής, επίσης γνωστή ως γεντιανή βιολέτα. Αφήστε το για 30-60 δευτερόλεπτα. Η κρυσταλλική βιολέτα (KV) διαχωρίζεται σε υδατικό διάλυμα σε ιόντα KV+ και χλωριούχου (Cl-). Αυτά τα ιόντα διεισδύουν στα κυτταρικά τοιχώματα και τις κυτταρικές μεμβράνες τόσο των θετικών κατά gram όσο και των gram-αρνητικών βακτηρίων. Το ιόν KV+ αλληλεπιδρά με τα αρνητικά φορτισμένα συστατικά των βακτηριακών κυττάρων, δίνοντας στα κύτταρα ένα μοβ χρώμα.
Πολλά εργαστήρια χρησιμοποιούν κρυστάλλινο ιώδες "Hucker", το οποίο περιέχει οξαλικό αμμώνιο για να αποτρέψει την καταβύθιση
Βήμα 2. Ξεπλύνετε απαλά το κρυστάλλινο ιώδες
Γείρετε τη διαφάνεια και χρησιμοποιήστε ένα μπουκάλι πλυντηρίου για να ψεκάσετε ένα μικρό ρεύμα αποσταγμένου νερού ή βρύσης πάνω από τη διαφάνεια. Το νερό πρέπει να ρέει πάνω από την επιφάνεια του επιχρίσματος και δεν πρέπει να ψεκάζεται απευθείας πάνω στο επίχρισμα. Μην ξεπλένετε υπερβολικά. Μπορεί να αφαιρέσει τη χρώση στα θετικά κατά Gram βακτήρια.
Βήμα 3. Ξεπλύνετε το επίχρισμα με ιώδιο και μετά ξεπλύνετε
Χρησιμοποιήστε ένα σταγονόμετρο για να ξεπλύνετε το επίχρισμα με ιώδιο. Αφήστε το να δράσει για τουλάχιστον 60 δευτερόλεπτα, στη συνέχεια ξεπλύνετε προσεκτικά με τον ίδιο τρόπο όπως παραπάνω. Το ιώδιο, με τη μορφή ενός αρνητικά φορτισμένου ιόντος, αλληλεπιδρά με το KV+ για να σχηματίσει ένα μεγάλο σύνθετο σύμπλεγμα μεταξύ κρυστάλλου ιώδους και ιωδίου (σύνθετο σύμπλεγμα CV-I) στο εσωτερικό και εξωτερικό στρώμα του κυττάρου. Αυτό το σύμπλεγμα ενώσεων θα διατηρήσει το ιώδες χρώμα του κρυσταλλικού ιώδους μέσα στο κελί, στις λεκιασμένες θέσεις.
Το ιώδιο είναι μια διαβρωτική ουσία. Αποφύγετε την εισπνοή, την κατάποση ή την επαφή με το δέρμα
Βήμα 4. Προσθέστε χλωρίνη χρώματος και μετά ξεπλύνετε γρήγορα
Ένα μείγμα ακετόνης και αιθανόλης 1: 1 χρησιμοποιείται συνήθως για αυτό το σημαντικό βήμα, το οποίο πρέπει να χρονομετρηθεί προσεκτικά. Τοποθετήστε τη διαφάνεια σε μια συγκεκριμένη γωνία και, στη συνέχεια, προσθέστε λευκαντικό χρώματος έως ότου δεν φαίνεται περισσότερο μοβ στο νερό που χρησιμοποιείται για το ξέβγαλμα. Αυτό συνήθως διαρκεί λιγότερο από 10 δευτερόλεπτα, ή ακόμα λιγότερο χρόνο εάν η χλωρίνη περιέχει υψηλή συγκέντρωση ακετόνης. Σταματήστε αυτό το βήμα αμέσως, διαφορετικά η χρωστική ουσία θα διαλύσει επίσης κρυστάλλινο ιώδες από τα θετικά κατά gram και αρνητικά κύτταρα και η διαδικασία χρώσης πρέπει να επαναληφθεί. Ξεπλύνετε αμέσως τυχόν περίσσεια χλωρίνης χρησιμοποιώντας την προηγούμενη τεχνική.
- Η καθαρή ακετόνη (95%+) μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως υποκατάστατο. Όσο περισσότερο ακετόνη χρησιμοποιείτε, τόσο πιο γρήγορα θα λειτουργεί το λευκαντικό, οπότε πρέπει να δώσετε μεγαλύτερη προσοχή στο χρονοδιάγραμμα.
- Εάν αντιμετωπίζετε προβλήματα με την παρακολούθηση της ώρας για αυτό το βήμα, προσθέστε χλωρίνη χρώματος σταγόνα -σταγόνα.
Βήμα 5. Πασπαλίστε την αντί-βαφή πάνω στο επίχρισμα και μετά ξεπλύνετε
Ένας αντίθετος λεκές, συνήθως σαφρανίνη ή φουξίνη, χρησιμοποιείται για να αυξήσει την αντίθεση μεταξύ gram-αρνητικών και gram-θετικών βακτηριδίων, χρωματίζοντας αποχρωματισμένα (αποχρωματισμένα) βακτήρια, δηλ. Αρνητικά κατά gram βακτήρια, ροζ ή κόκκινο. Αφήστε για τουλάχιστον 45 δευτερόλεπτα, στη συνέχεια ξεπλύνετε.
Η φούξιν θα λερώσει έντονα πολλά αρνητικά κατά gram βακτήρια, όπως το Haemophilus spp και το Legionella spp. Αυτή η μέθοδος είναι καλή για αρχάριους
Βήμα 6. Στεγνώστε τη διαφάνεια
Μπορείτε να τα στεγνώσετε σε υπαίθριο χώρο για να στεγνώσουν ή να τα στεγνώσετε χρησιμοποιώντας βιβλικό με βιβλία που πωλείται για αυτόν τον σκοπό. Η διαδικασία χρώσης Gram έχει ολοκληρωθεί.
Μέθοδος 3 από 3: Έλεγχος των αποτελεσμάτων χρωματισμού
Βήμα 1. Προετοιμάστε το μικροσκόπιο φωτός
Τοποθετήστε τη διαφάνεια κάτω από το μικροσκόπιο. Τα βακτήρια διαφέρουν πολύ σε μέγεθος, επομένως η συνολική μεγέθυνση που απαιτείται θα κυμαίνεται από 400x έως 1000x. Συνιστάται ένας αντικειμενικός φακός με λάδι εμβάπτισης για ευκρινέστερη εικόνα. Ρίξτε το λάδι εμβάπτισης στη διαφάνεια, αποφεύγοντας την κίνηση ενώ στάζετε για να αποφύγετε τη δημιουργία φυσαλίδων. Μετακινήστε τη λαβή του φακού μικροσκοπίου έτσι ώστε ο αντικειμενικός φακός να ασφαλίσει στη θέση του και να αγγίξει το λάδι.
Η εμβάπτιση λαδιού μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο σε ειδικά σχεδιασμένους φακούς και όχι σε "ξηρούς" φακούς
Βήμα 2. Προσπαθήστε να προσδιορίσετε gram θετικά και gram αρνητικά βακτήρια
Εξετάστε τη διαφάνεια κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός. Τα θετικά κατά gram βακτήρια εμφανίζονται σε μοβ χρώμα, επειδή το κρυστάλλινο ιώδες παγιδεύεται μέσα στο παχύ κυτταρικό τοίχωμα. Τα gram-αρνητικά βακτήρια θα έχουν ροζ ή κόκκινο χρώμα, επειδή το κρυστάλλινο ιώδες ξεπλένεται μέσα από τα λεπτά τοιχώματα των κυττάρων, όπου εισέρχεται η ροζ αντί-βαφή.
- Εάν το δείγμα είναι πολύ παχύ, το αποτέλεσμα μπορεί να είναι ψευδώς θετικό. Χρωματίστε ένα νέο δείγμα εάν εμφανίζει όλα τα gram θετικά βακτήρια, για να βεβαιωθείτε ότι το αποτέλεσμα είναι σωστό.
- Εάν χρησιμοποιείτε πολύ χλωρίνη χρώματος, το αποτέλεσμα μπορεί να είναι ψευδώς αρνητικό. Χρωματίστε ένα νέο δείγμα εάν εμφανίζει όλα τα αρνητικά κατά gram βακτήρια, για να βεβαιωθείτε ότι το αποτέλεσμα είναι σωστό.
Βήμα 3. Συγκρίνετε τα αποτελέσματα που βλέπετε με την εικόνα αναφοράς
Εάν δεν γνωρίζετε πώς μοιάζουν τα βακτήρια, μελετήστε τη συλλογή εικόνων αναφοράς, συνήθως ταξινομημένων κατά σχήμα και χρώση Gram. Μπορείτε επίσης να δείτε διαδικτυακές βάσεις δεδομένων στο [National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos και πολλούς άλλους διαδικτυακούς ιστότοπους. Για διευκόλυνση της ταυτοποίησης, παρακάτω παρατίθενται παραδείγματα βακτηρίων που συναντώνται συνήθως ή είναι σημαντικά για τη διάγνωση, ταξινομημένα ανάλογα με την κατάσταση και το σχήμα τους Gram.
Βήμα 4. Προσδιορίστε gram-θετικά βακτήρια με βάση το σχήμα τους
Τα βακτήρια ταξινομούνται περαιτέρω ανάλογα με το σχήμα τους στο μικροσκόπιο, πιο συχνά ως κόκκοι (σφαιρικά) ή ράβδοι (κυλινδρικά). Ακολουθούν ορισμένα παραδείγματα gram-θετικών βακτηρίων (μοβ χρώματος) ανάλογα με το σχήμα τους:
- Gram θετικοί κόκκοι συνήθως σταφυλόκοκκοι (που σημαίνει κόκκοι ομάδας) ή στρεπτόκοκκοι (που σημαίνει κόκκοι αλυσίδας).
- Γραμμοθετικές ράβδοι όπως Bacillus, Clostridium, Corynebacterium και Listeria. Τα βακτήρια ράβδου Actinomyces spp. συνήθως έχουν κλαδιά ή νημάτια.
Βήμα 5. Προσδιορίστε gram αρνητικά βακτήρια
Τα gram-αρνητικά βακτήρια (ροζ χρώματος) συχνά ταξινομούνται σε τρεις ομάδες. Οι κόκκοι έχουν σφαιρικό σχήμα, οι ράβδοι είναι μακριές και λεπτές, ενώ οι κοκοειδείς ράβδοι βρίσκονται ενδιάμεσα.
- Gram αρνητικοί κόκκοι Το πιο συνηθισμένο είναι το Neisseria spp.
- Γραμμικά αρνητικές ράβδοι π.χ. E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, και πολλά άλλα. Το Vibrio cholerae μπορεί να θεωρηθεί ως κανονικό στέλεχος ή λυγισμένο στέλεχος.
- Gram-αρνητικά βακτήρια ράβδων "κοκκοειδή" (ή "κοκοκοβακίλλια") π.χ. Bordetella, Brucella, Haemophilus και Pasteurella
Βήμα 6. Ελέγξτε προσεκτικά εάν τα αποτελέσματα είναι ανάμεικτα
Ορισμένα βακτήρια είναι δύσκολο να χρωματιστούν με ακρίβεια, λόγω της ευθραυστότητας ή της κηρώδους φύσης των κυτταρικών τοιχωμάτων τους. Αυτά τα βακτήρια μπορεί να εμφανίζουν ένα μείγμα μοβ ή ροζ στο ίδιο κύτταρο ή μεταξύ διαφορετικών κυττάρων στο ίδιο επίχρισμα. Δείγματα βακτηρίων παλαιότερα από 24 ώρες μπορεί να δείξουν αυτό το πρόβλημα, αλλά υπάρχουν επίσης ορισμένα είδη βακτηρίων που παραμένουν δύσκολο να χρωματιστούν σε οποιαδήποτε ηλικία δειγματοληψίας. Αυτά τα βακτήρια απαιτούν πιο εξειδικευμένες εξετάσεις για την ταυτοποίηση, όπως χρώση με οξέα, παρατήρηση σε βακτηριακή καλλιέργεια, μέσα καλλιέργειας TSI ή γενετικό έλεγχο.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium, και Propionibacterium spp. Όλα είναι θετικά κατά gram βακτήρια, αλλά συχνά δεν είναι βαμμένα.
- Μικρά, λεπτά βακτήρια όπως Treponema, Chlamydia και Rickettsia spp. δύσκολο να λεκιάσει με τη μέθοδο Gram.
Βήμα 7. Απορρίψτε τυχόν εναπομείναντα αναλώσιμα και εξοπλισμό
Αυτή η διαδικασία διάθεσης απορριμμάτων ποικίλλει μεταξύ εργαστηρίων και εξαρτάται από τα υλικά που χρησιμοποιούνται. Συνήθως, το υγρό στο δίσκο χρώσης απορρίπτεται σε φιάλες με επισήμανση ως επικίνδυνα απόβλητα. Μουλιάστε τις πλάκες σε διάλυμα χλωρίνης 10% και στη συνέχεια απορρίψτε τις σε ένα δοχείο αιχμηρών αντικειμένων.
Συμβουλές
- Θυμηθείτε ότι τα αποτελέσματα χρώσης Gram θα είναι καλά μόνο εάν το δείγμα είναι καλό. Είναι σημαντικό να ενημερώνετε τους ασθενείς ώστε να μπορούν να παρέχουν ένα καλό δείγμα (π.χ., η διαφορά μεταξύ του φτύματος έναντι του βαθύ βήχα για τη λήψη δείγματος πτυέλων).
- Ως χλωρίνη, η αιθανόλη αντιδρά πιο αργά από την ακετόνη.
- Τηρείτε τους τυπικούς κανονισμούς εργαστηρίου για να διασφαλίσετε την ασφάλεια.
- Χρησιμοποιήστε ένα μάκτρο μάγουλας για εξάσκηση, γιατί περιέχει τόσο θετικά κατά gram όσο και αρνητικά κατά gram βακτήρια. Εάν βλέπετε μόνο έναν τύπο βακτηρίων, μπορεί να χρησιμοποιείτε πολύ λίγο ή πολύ χλωρίνη.
- Μπορείτε να χρησιμοποιήσετε ξύλινα κουμπώματα για να στερεώσετε τη διαφάνεια.
Προειδοποίηση
- Η ακετόνη και η αιθανόλη είναι εύφλεκτες ουσίες. Η ακετόνη θα αφαιρέσει το λάδι από τα χέρια σας, διευκολύνοντας το δέρμα σας να απορροφήσει άλλες χημικές ουσίες. Φορέστε γάντια και χρησιμοποιήστε τα με προσοχή.
- Μην αφήνετε το επίχρισμα να στεγνώσει πριν ξεπλύνετε τον λεκέ Gram ή τον αντίχρωμα.
Ο, τι χρειάζεσαι
- Δείγμα δικτύου
- Γυάλινη διαφάνεια
- Σταγονόμετρο
- Μικρή πηγή πυρκαγιάς, ή θερμοσίφωνας, ή μεθανόλη
- Νερό
- Κρυστάλλινη βιολέτα
- Ιώδιο
- Χρωστική χλωρίνη, όπως αλκοόλ ή ακετόνη
- Σαφρανίνη
